Enzim restriksi adalah enzim yang memotong DNA tunggal dan double-untai. Setiap enzim restriksi memiliki urutan nukleotida spesifik, yang disebut situs restriksi, yang dikenali dan dipotong. Enzim restriksi digunakan untuk sekuensing DNA, analisis mutasi, dan kloning dan amplifikasi DNA. Para ilmuwan menggunakan enzim restriksi untuk memasukkan gen yang diminati ke dalam vektor ekspresi, molekul DNA yang dapat mereplikasi secara terpisah dari DNA kromosom. Vektor yang mengandung gen bunga kemudian dapat dimasukkan ke dalam strain bakteri untuk ekspresi dan karakterisasi protein.
Video of the Day
Langkah 1
Identifikasi situs enzim restriksi pada vektor Anda dengan melihat peta pembatasan. Peta pembatasan akan memberi tahu Anda enzim mana yang akan memotong vektor Anda, dan di mana.
Step 2
Pilih enzim restriksi yang juga memiliki situs yang ada pada sisipan gen Anda, dengan melihat urutan sisipan. Pastikan situs restriksi berada pada posisi di sisipan Anda yang berada di luar gen yang diminati, jadi Anda tidak kehilangan sebagian gennya.
Langkah 3
Pastikan tidak ada duplikat situs pembatasan di manapun pada sisipan atau vektor gen Anda. Ini akan menyebabkan banyak pemotongan DNA Anda dan memberi Anda data yang menyesatkan.
Langkah 4
Cobalah untuk memilih enzim restriksi yang dipotong dengan ujung lengket, bukan ujung tumpul. Ujung lengket terjadi ketika enzim memotong DNA terdampar ganda dengan cara yang terhuyung, meninggalkan satu overhang terdampar yang memfasilitasi keterikatan dengan sisipan potong dengan cara yang berlawanan. Ujung tumpul terjadi ketika DNA beruntai ganda dipotong dengan cara yang halus, dan ini lebih sulit dilampirkan.
Langkah 5
Pilih enzim restriksi yang berbeda untuk kedua ujung sisipan Anda untuk memastikan dimasukkan ke dalam vektor pada orientasi yang benar dan untuk memastikan vektor tidak menempel kembali pada dirinya sendiri.
Langkah 6
Cobalah untuk memilih dua enzim restriksi yang berfungsi dengan baik pada sistem penyangga dan suhu yang sama. Jika ini tidak mungkin, jalankan setiap pencernaan secara terpisah.
Hal-hal yang Anda perlukan
- Urutan memasukkan gen
- Peta pembatasan untuk vektor pilihan
- Daftar enzim restriksi dan situs pemotongnya
Tip
- Beberapa program web telah dikembangkan untuk mengidentifikasi situs restriksi sekuens DNA dengan cepat. Salah satu program tersebut adalah dari New England BioLabs.
